基因工程的基本操作程序

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第一步：目的基因的获取
1.目的基因是指： 编码蛋白质的结构基因 。
2.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。
3.PCR技术扩增目的基因
（1）原理：DNA双链复制
（2）过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链；第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。
第二步：基因表达载体的构建
1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。
2.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因
（1）启动子：是一段有特殊结构的DNx片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。
（2）终止子：也是一段有特殊结构的DNx片段 ，位于基因的尾端。
（3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。
第三步：将目的基因导入受体细胞_
1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
2.常用的转化方法：
将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是 农杆菌转化法，其次还有 基因b88枪88b法和 花粉管通道法等。
将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 显微注射技术。此方法的受体细胞多是 受精卵。
将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少 ，最常用的原核细胞是 大肠杆菌 ，其转化方法是：先用 Ca2+ 处理细胞，使其成为 感受态细胞 ，再将 重组表达载体DNA分子 溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。
3.重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。
第四步：目的基因的检测和表达
1.首先要检测 转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用 DNA分子杂交技术。
2.其次还要检测 目的基因是否转录出了mRNA，方法是采用 用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。
3.最后检测 目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取 蛋白质，用相应的 抗体进行抗原－抗体杂交。
4.有时还需进行 个体生物学水平的鉴定。如 转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。

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